引言

二氢蝶酸还原酶（Dihydrofolate Reductase, DHFR）是生物体内叶酸代谢途径中的关键酶，负责催化二氢叶酸（DHF）还原为四氢叶酸（THF）。THF是核酸和氨基酸合成的重要辅因子，尤其在DNA复制和细胞增殖中不可或缺。因此，DHFR的活性与细菌、寄生虫及肿瘤细胞的生长密切相关，成为抗生素、抗疟药物和化疗药物的重要靶点。准确检测DHFR的活性及其抑制效应，对药物研发、耐药性监测及临床诊疗具有重要意义。本文将系统阐述DHFR检测的适用范围、核心项目、常用方法及配套仪器。

检测范围

DHFR检测广泛应用于以下领域：

• 医药研发：筛选DHFR抑制剂，评估抗肿瘤、抗感染药物的效能；
• 临床诊断：监测病原微生物（如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）的耐药性；
• 农业与食品科学：评估农药残留对微生物叶酸代谢的影响；
• 基础研究：解析酶催化机制及基因突变导致的活性变化。

检测项目

DHFR检测的核心指标包括：

• 酶活性测定：量化单位时间内THF的生成量；
• 抑制剂半数抑制浓度（IC₅₀）：评估药物或化合物的抑制效率；
• 酶动力学参数：如米氏常数（K_m）和最大反应速率（V_max）；
• 基因表达水平：通过qPCR或Western blot分析DHFR的表达量。

检测方法

1. 分光光度法

基于DHFR催化反应中辅因子NADPH的氧化过程，通过检测340 nm波长处吸光度的下降速率来计算酶活性。该方法操作简便、成本低，但易受样品杂质干扰。

2. 液相色谱法（HPLC）

通过色谱柱分离反应产物THF，利用紫外检测器定量分析。HPLC灵敏度高、特异性强，适用于复杂生物样本的检测，但设备昂贵且耗时较长。

3. 荧光法

使用荧光探针（如甲氧苄啶衍生物）标记酶活性位点，通过荧光信号变化实时监测反应进程。该方法灵敏度优于分光光度法，适合高通量筛选。

4. 酶联免疫吸附法（ELISA）

利用DHFR特异性抗体捕获酶蛋白，结合酶标二抗显色定量。ELISA适用于低浓度样本检测，但无法区分活性酶与非活性形式。

检测仪器

• 紫外-可见分光光度计：用于分光光度法的吸光度检测，需配备恒温比色皿；
• 液相色谱仪：配备C18反相色谱柱及紫外检测器，流速通常设置为1 mL/min；
• 荧光酶标仪：支持96/384孔板检测，激发波长280 nm，发射波长450 nm；
• 实时定量PCR仪：用于DHFR基因表达分析，需配合SYBR Green或TaqMan探针。

结论

DHFR检测作为评估叶酸代谢状态及药物作用机制的核心技术，其方法学选择需结合检测目的与样本特性。分光光度法和荧光法适合常规活性筛查，而HPLC和ELISA则适用于精准定量。随着基因编辑技术与单细胞分析的发展，未来DHFR检测将趋向更高灵敏度与多维度的动态监测，为个性化医疗和新型抑制剂开发提供更强大的工具支持。

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